واکنش زنجیره یی پولیمیراز- PCR

 واکنش زنجیره یی پولیمیراز(Polymerase Chain Reaction–PCR )

  مقدمه

    همگام با پیشرفت های ارزنده درساحات مختلف علمی، امروزه رازهای نهفته مهم وحیاتی فراوان دربخش بیولوژی مالیکولی آشکارگردیده است. شناخت واکنش زنجیره یی پولیمیراز/ Polymerase Chain Reaction) PCR) یکی ازشگفت انگیزترین دستآوردهای علمی سه دهه اخیر می باشد.

PCR انقلاب تازه یی درعرصه های مختلف علمی تشخیصی وتحقیقاتی درجهان به میان آورد و خود اکتشاف بزرگ درصد سال اخیربه شمارمیرود. PCR  در دهه اخیر به وسیله یی ضروری  در راستای بهبود سلامت بشر، به ویژه در جهت تشخیص امراض مدهش مبدل گردیده است. در نهایت این بخش مهم علمی راه را برای شناخت رازهای ناشناخته هستی هموار کرده است.
امروزه تمامی پیشرفت های علمی ارزنده دربخش های تحقیقی وتشخیصی شعبات طب انسانی، طب حیوانی، علوم حیوانی و گیاهی، مایکروبیولوژی، درنهایت شناخت دقیق ومعیاری تمامی رشته های علمی وابسته به حیات، همه مدیون این فنآوری ارزنده می باشند.
تاجایی که دستیابی به پروسه های تشخیص، مداوا وپیشگیری خیلی ازبیماری های مهم انسانی، حیوانی ونباتی، بدون استفاده ازروش های گوناگون PCR دشوار و دربسا موارد ناممکن می باشد. 

خوشبختانه درچند سال اخیرآ امکان استفاده ازتخنیک PCR دربخش تشخیص بیماری های حیوانی درکشورما نیزفراهم گردیده است. اما با توجه به اهمیت ارزنده کاربرد روشهای PCR در انکشافات علمی تحقیقاتی وتشخیصی اخیردرجهان، نیازاست تا استفاده همه جانبه ازاین فنآوری درمراکزعلمی تحقیقاتی، دانشگاه ها ومراکزعرضه خدمات طبی کشورما بیشتررایج گردد. 

ذکراین نکته ضروریست که علاوه برسایر روش های فنی لابراتواری، آموزش و راه اندازی روش های PCR بویژه درموارد تشخیصی کلینیکی وتحقیقاتی طب انسانی، طب حیوانی وسایربخش های علمی کشور ازضرورت های اساسی میباشد. چنانکه عملی ساختن روش های تحقیقاتی نوین خود سرآغازیک تحول بزرگ درعرصه انکشافات خدمات طبی وتحقیقاتی علمی برای کشورعزیزما افغانستان خواهد بود.
آموزش روش های عملیPCR  برای دانشجویان رشته های مختلف علوم حیات به ویژه متخصصین طب حیوانی، نهایت ضروری می باشد.
به منظورفراهم ساختن معلوماتی چند درمورد شناخت وچگونگی کاربرد برخی ازروشهای PCR این نوشته برای آنعده ازدانشجویان عزیزعلوم طبی و زراعتی که تاحال با این روش مفید کارنکرده اند، فراهم گردیده است. تاباشد که عزیزان ما با موارد چگونگی عملکرد و راه های استفاده ازاین روش مدرن بیشترآشنا شوند. امید آن است که روزی تدریس معیاری این روش علمی درنصاب تعلیمی دانشکده های وترنری افغانستان جا گیرد. 

تعریف

   PCR یک تخنیک یا عملکرد مالیکولی است، که تحت شرایط خاص از مالیکولهای DNA یا RNA  حجرات کاپی های متعدد صورت میگیرد. این عملکرد مالیکولی به وسیله یی واکنش انزایماتیک (Enzymatic reaction) ازیک رشته DNA درمدت زمان کم هزاران کاپی مورد نظررا تولید میکند.

 به‌ عقيده‌ بيولوژی دانها، PCR وسيله‌ ییست‌ كه‌ سوزنی‌ را دركوهی‌ ازكاه‌ پيدا ميكند. PCR  از نظر اصول‌ عملی‌ مشابهت های زياد به‌ همانند سازی DNA ‌ دارد و درواقع‌ برگرفته‌ از آن است‌.... بطوركلي‌ دوفرق‌ بين تخنیک PCR و روش همانند سازی/ تکثیر طبعی DNA وجود دارد: همانند سازي‌ با حرارت 37 درجه با بکارگیری انزايم‌ DNA پوليمیراز و انزايم های‌ ديگر دربدن‌صورت‌ ميگيرد. درتخنیکPCR به‌ علت‌ نيازبه‌ درجه‌ حرارت‌ بالا  ابتدا برای جدا‌ شدن‌ رشته ها از انزايم‌ مقاوم‌ به‌ حرارت‌ همانند Taq استفاده‌ می‌شود و به‌ جایی‌ عملکرد سايرانزايم ها ازایجاد تغييرات‌ متداول درجه‌ حرارت‌ استفاده‌ مي‌شود.

تاریخچه: 
PCR درسال 1983 میلادی یعنی حدود 28 سال قبل توسط Dr. Kary B Mullis  امریکایی، منحیث یک روش ساده مطرح شد.

گرچه درسال 1972 م Gobind Khorana (امریکایی هندی تبار) توضیحاتی در مورد امکان کاپی سازی رشته های DNA نشرکرده بود، اما معلومات وی درهمان محدوده باقی ماند. تا آنکه Mullis با این تفکرشگفت انگیزخود که درحین راننده گی دریک شب مهتابی به ذهنش خطورکرده بود، توانست دوجایزه بزرگ که یکی جایزه مشهورنوبل وهمزمان جایزه با ارزش علمی جاپان را درسال 1993میلادی نصیب شود ونام خود را دررده یی استوره های علمی جهان ثبت نماید.

ماشین قدیمی  PCR 

 نوع  ماشین جدید PCR

سال های بعد ازکشف PCR شرکت های تولید کننده لوازم تحقیقاتی ماشین های PCR را درانواع مختلف تولید وبه بازارعرضه نمودند. درحال حاضردستگاه های مدرن وعصری مجهزبا سیستم خودکار، که تمام مراحلPCR  را به شکل ازپیش تنظیم شده اجرامیکنند، دراختیارلابراتوارهای علوم حیات درسرتاسرجهان قراردارد. همچنان کمپنی های که معرف های کیمیاوی (Reagents) را برای لابراتوارها تولید میکنند، بسته های استاندرد مواد مورد نیاز PCR (PCR kits) را تولید وعرضه میدارند، که این خود سهولت بیشتردرکارهای لابراتواری دربخش PCR ایجاد کرده است.

 بسته های استاندرد مواد مورد نیاز  PCR (PCR kit)  

 کاربرد تشخیصی PCR

    این روش درمدت زمان کم نتایج دقیق وارزنده را که توسط سایرروش های تشخیصی لابراتواری ممکن نیست، ارایه میدارد. امروزه کاربرد تشخیصی PCR دربخش های مختلف علوم  حیات مانند: طب، زراعت، علم ژنیتک، فوسیل شناسی،  تکنالوژی مواد غدایی، تحقیقات عدلی قضایی، وغیره، بیشترین استفاده را دارا بوده و منحیث فنآوری برتر، جایگاه ویژه دارد . 
دراین بخش جا دارد تا بطوراجمالی ازاستفاده PCR دربخش تشخیص برخی بیماری ها، اشاره گردد.

دربخش علوم طبی، با استفاده از PCRمیتوان زود ترازآزمایش الیزا-ELISAT ویروس بیماری ایدز را درهفته های اول مصابیت باشناسایی RNA ویروس عامل در وجود انسان و حیوان مبتلا تشخص نمود. درحالیکه آزمایش ELISA درعضویت بیماربه دنبال انتی بادی های تولید شده میگردد. واضح است که موجودیت انتی بادی قابل دریافت درعضویت نمایانگرپیشرفت بیماری بوده،  و آن زمانیست که فرصت مناسب برای تداوی  ویا کنترول گسترش بیمارازدست رفته است.

همچنان، درمورد اهمیت PCR میتوان ازمواردی مانند تشخیص وتداوی بیماری های ژینتکی جنین، تشخیص و برطرف نمودن ناسازگاری گروپ های خون والدین قبل ویا بعد از باردا شدن مادر، تشخیص به موقع انواع سرطان ها، تشخیص تغییرات زیان آور کانال هضمی (که درنتیجه تغییرات ژنتیکی منجربه ایجاد تومورهای کانال هضمی میگردد)، وغیره، یاد آورشد.

استفاده ازPCR درطبابت حیوانی دربخشهای تحقیقات علمی، تشخیص کلینیکی  و اپیدیمیولوژیکی، وغیره کاربرد وسیع دارد. امروزه از PCR دربیشتر پروژه های تحقیقاتی علمی وترنری، استفاده بزرگ صورت میگیرد. چه بسا مواردی که نتیجه تحقیقات علمی دربخش طب وترنری راه گشای دریافت های مهم درراستایی پیشگیری بیماری های مشترک حیوانی وانسانی بوده است. بگونه مثال، میتوان ازتحقیقات درمورد چگونگی مبارزه ومحو بیماری های انفلانزای پرنده گان، انفلاانزای خوکی و ده ها بیماری دیگرنام برد.

قبل ازآنکه به جزئیات پیرامون معرفی روشهای PCR بپردازیم، نظرگذرا به گرداننده اصلی عملیه یعنی DNA می اندازیم.

 DNA) Deoxyribonucleic acid):

     کشف ماده‌ یی که بعدها DNAنام گرفت، در سال 1868میلادی بوسیله  بیولوژی دان سویسی فریدریک میشر

(Friedrich (Miescher انجام شد. این دانشمند هنگام مطالعه کرویات سفید خون، هسته این حجرات را استخراج کرد و سپس بروی آن محلول القلی ریخت، حاصل این آزمایش، رسوب چسپناکی بود که بررسیهای کیمیاوی آن نشان داد، ترکیبی از کاربن، هایدروجن، اوکسیجن، نایتروجن و درصد بالایی از فاسفورمی‌باشد. Miesher این ماده را نوکلئین

( Nuclein)نامید.  
دریک تعریف ساده، DNA( دی اوکسی ریبونوکلئیک اسید)، عبارت از اسید هستوی که متشکل از تعداد زیادی نیکلئوتید که در دو رشتة دراز مار پیچ به هم متصل اند ، میباشد.  
زمانیکه ماهیت اسیدی این ماده مشخص گردید، نام آن به دی اوکسی ریبونکلئیک اسید 

deoxyribonucleic acid-DNA)) تغییر یافت. درسال 1953میلادی ساختمان سه بعدیDNA ، بوسیله Waston  و همکاران وی ارایه گردید. مدل پیشنهادی آنان چنین بود، کهDNA یک مارپیچ دورشته ‌یی است که رشته ‌های آن به دور یک محورمرکزی )معمولا به صورت راست مدور( پیچ ‌خورده اند. طبق مدل واتسون وهمکاران ستونهای قند- فوسفات phosphate همانند پله ‌های زینه به دوقسمت خارجی القلیهای عضوی Organic base پیچیده و به این ترتیب درمرکز حجرات قرار دارند.

DNA   حجرات ایوکاریوتیک (eukaryotic) درهسته و درحجرات پروکاریوتیک Prokaryotic ) ) درسایتوپلازم حجره قرار دارد وحاوی معلومات ژنتیکی مورد استفاده برای رشد و نمو وتمام فعالیت های جانداران است.  

نقش اصلیDNA  ذخیره درازمدت اطلاعات ژنتیکی حجره است. به همین دلیل DNA را اغلب با مجموعه‌ یی ازنقشه‌ها مقایسه می‌کنند، چراکه حاوی دستورات مورد نیازبرای ساختن تمام اجزایی دیگر حجرات مانند ما لیکول‌های پروتین و ریبونوکلئیک اسید یا RNA  وغیره، می باشد.  قطعاتی از DNA که اطلاعات ژنتیکی را حمل می‌کنند، ژن / Gene نامیده می‌شوند، اما سایربخش‌ها در زنجیره DNA اهداف ساختمانی دارند و یا درتنظیم و تولید پروتین ها درحجره نقش دارند.

 DNAازلحاظ ترکیب کیمیاوی یک آرایش طولانی از واحدهای ساختمانی ساده‌ به نام نوکلئوتیدها است، که چارچوب آنها از چهار قند  cytosine (S), guanine (G) and thymine (T) )  (adenine (A),  و گروه‌های فسفات تشکیل شده است که با پیوندهای طولانی به هم متصل هستند( شکل ذیل ).

    ساختمان DNA

استخراج DNA ‌براي استفاده PCR ‌:

‌‌‌‌نقطه شروع‌ بسياری از روشهای‌ بيولوژی مالیكولی ضرورت‌ جداسازی DNA با كيفيت‌ عالی است. معمولا كيفيت DNA با عواملی‌ از قبيل‌ عدم‌ آلودگی‌ ناشی‌ از RNA، پروتين، ليپيد و سايرساختارهای‌ كه‌ برای‌ انزايم های ویژه‌ و پوليمیرازها مزاحمت‌ ايجاد میكنند، سنجيده‌ مي‌شود. به‌ علت‌ طویل و شکنند بودن‌ DNA ‌پستانداران، روشهای‌ استخراج DNA ‌ بايد حداقل‌ فشار‌میخانيكي‌ را در طي‌ عملکرد استخراج‌ ايجاد نمايند.‌‌‌‌ معمولا روشهایی‌ كه‌ در آنها چندين‌ شستشو دهنده مانند SDS ‌ و tritonX100 استفاده‌ ميشود.  كه‌ نقش‌ آنها تجزیه نمودن‌ حجرات‌ وكمك‌ به‌ از بين‌ بردن‌ پروتين‌ متصل‌ بهDNA می‌باشد.
پروتين‌زدایی بيشتر بوسیله انزایم پروتيئناز K صورت‌ می‌گيرد، كه‌ اين‌ ماده‌ در بفرتجزیه كننده‌ مورد استفاده‌ قرار ميگيرد. اين‌ انزايم‌ درحضور SDS درحرارت ‌56-65 درجه فعاليت‌ دارد و تحت‌ اين‌ شرايط‌ پروتين‌ بهتر تفکیک و تجزیه می ‌شود. برعكس‌درهمين‌ شرايط‌ انزايم های‌ ديگر مثل DNAase ‌ متغییر (denature‌) می‌شود.‌‌‌‌ متعاقب‌ آن استفاده‌ از انزایم  پروتيئنازK از ايزوپروپانول‌ برای‌ ازبين‌ بردن‌ موثر پروتين‌ها استفاده میشود  و باقيمانده‌ پروتين‌ و ليپيدها نيز بطور موثر ازطريق‌ كاربرد فینول‌ وكلروفورم‌ از بين‌ می ‌رود. آلودگی RNA ‌ ازطريق‌ مراقبت كردن‌ نمونه‌ با RNAase از بين‌ ميرود.‌‌‌‌ در روشهای‌ ديگر بعد از پروتئينازK از نمك‌ اشباع‌ برای‌ رفع‌ آلودگی‌ پروتين‌ استفاده‌ میشود. دراستخراج DNA ‌ برای PCR‌ بهتراست‌ از Heparin‌  استفاده‌ نشود، چون‌ هیپارين‌ ازفعاليت Taq پليمیراز جلوگيري‌ می‌كند. وجود EDTA حداقل mM ‌2  در بفراستخراج‌ باعث‌ ميشود كه‌ كوانزايم های‌ انزايم ‌ DNAase ‌با EDTA حل‌ شود  و از تجزيه‌ تصادفی DNA‌ جلوگيري‌ نمايد.

 مراحل اصلی PCR :

PCR در طی سه مرحله اصلی ذیل صورت میگیرد:

1. مرحله تغییرماهیت (Denaturation Step ) :

در این مرحله دو رشته مالیکول های DNA بوسیله حرارت (حدود ċ  95) از همدیگر جدا گردیده و به

مالیکول های یک رشته ای تبدیل میگردند.

2. مرحله پیوند (Annealing or Hybridization Step) :

در این مرحله رشته های جداشده DNA با پرایمر ها پیوند میشوند. عملیه پیوند پرایمر ها با رشته های DNA در حرارت متغییر (ċ 72 – 30) صورت میگیرد.

3. مرحله توسعه (Extension Step) :

در این مرحله انزایم DNA پولیمیراز( DNA Polymerase ) یا (Taq Polymerase)، پرایمر ها را روی رشته های جدا شده DNA امتداد می دهد و در نتیجه دوکاپی جدید DNA تولید میگردد.

انواع PCR :  

PCR به شعبات متعدد تقسیم گردیده که هر کدام نظر به کابرد تشخیصی و تحقیقی با روش های مختلف اجر می گردد.

اصطلاحات ذیل برخی از روش های PCR را افاده می کند:

- RT-PCR) reverse transcription PCR):

- Q-PCR) quantitative PCR):

- Quantitative RT-PCR:

- Asymmetric PCR:

- Real- Time PCR :

- Multiplex PCR:

- Hot-Start PCR:

- Colony PCR:

- RAPD-PCR :

- Nested PCR :

- Inverse PCR :

-

-

-

-  Real time PCR:

در اين سيستم تشخيصی يك ماده دارای قابلیت تشعشع (Fluorescent) درطي واكنش متناسب با ميزان محصولات هرچرخهPCR آزاد ميشود وميزان تشعشع آن توسط ردیاب خودکار شناسايي وثبت ميگردد. بدين گونه ميزان DNA تكثير شده طی يك چرخه تا چرخه بعدی را ميتوان اندازه  گيري کرد.

برمبنای اين روش ميزان محصول PCR درهرچرخه قابل رديابی است. درحاليكه محصول روشهای معمول پس ازپايان واكنش نهایی مشخص ميشود.

روشهاي سنجش با  Realtime PCR:

1- استفاده از رنگهای تشعشع دهنده مانند سايبرگرين(SYBR Green) :

همزمان با دورشته یی شدن DNA سايبرگرين به رشته كوچك DNAمتصل ميشود وبا جذب طول موج498 نانومتری، نور522 نانومتری را پدیدار مي كند. با افزايش مقدارمحصول PCRرنگ بيشتری به رشته ها متصل ميشود و ميزان تابش نور(Fluorescence ) افزايش مي يابد ، پس ميزان نور تابی متناسب با مقدار DNA دورشته یی در واكنش است. اما مهمترين عيب آن اتصال به دو رشته هايي مثل پرايمردايمر و ديگر باندهای غيراختصاصي است كه باعث مي شود نتايج بيشتر ازغلظت اصلی برآورد شود.

2- استفاده از پروبهاي فلورسنت (Fluorescent probes) :

پروبها برخلاف سايبرگرين براساس تشخيص اختصاصي پیهم محصول كار ميكنند. پروبها معمولا يك رنگ تشعشع زا درانتهاي َ5(Reporter) و يك رنگ خاموش كننده درانتهای 3َ (Quencher) دارند و وقتي در فاصله مالیكولي نزديكي قراردارند بازتابش آن در دستگاه ثبت نميشود. اما پس از جدايی نور گسترنده از Reporter توسط Quencher قابل جذب نيست و توسط دستگاه بصورت تشعشعی قابل اندازه گيري است. مثلا استفاده ازپروب Taq Man كه اساس آن انزایم Exonulease DNA پوليمراز Taqاست. يك پروب 30-20 نوكلئوتايد كه در انتهای 5َ به يك رنگ Fluoresces متصل است و در انتهاي 3َ به يك عامل خاموش كننده. پروب حدود چند باز بعداز انتهای 3َ يكي ازپرايمرها طراحي ميشود انزايم پس از نزديك شدن به پروب با استفاده از فعاليت َ3 à 5انزایم Exonulease خود پروب را تجزیه ميكند و در نتيجه رنگ Fluoresces از عامل خاموش كننده جدا ميشود و باعث ايجاد Fluoresces ميگردد.

- روش PCR نامتقارن (Asymmetric PCR): 

هدف ازبكارگيری اين روش توليد DNA یک رشته یی است. در اين روش يكی از پرايمرها به تعداد كمتر و پرايمر ديگر بيشتر به محيط واكنش اضافه می شود تا جایيكه اين نسبت 1:50 يا 1:100 برسد. در حدود 20 چرخه ابتدايیPCR محصول دو رشته یی به صورت فاز نمايی توليد مي گردد. اما پس از 20 چرخه كه غلظت پرايمر كمتر در واكنش قابل چشم پوشی است وبه عبارت عاميانه تر به دليل تمام شدن پرايمر با غلظت كمتر درچرخه های بعدی PCR فقط يك رشته ازالگوی مورد نظر به صورت خطی تكثير می یابد. پس از پايان مراحل PCRچند نسخه DNA دو رشته یی و تعداد زيادی DNA تك رشته یی از ژن مورد نظر ايجاد خواهد شد. 

- ARMS PCR : روش PCR برای شناسایی تغییرات (Amplification Refractory Mutation System) :

اين روش تحت عنوان تكثيراختصاصی نوسان ها باکاربردPCR نيز ناميده ميشود، که در مطالعات ژنیتیکی مورد استفاده بیشتر دارد. اين روش برای تشخيص جهش های (Mutation ) نقطه یی به كارمی رود وجهت تشخيص پراکندگی های طبيعي و جهش يافته طراحی شده است. اين روش برپايه تفاوت نوكلئوتيدانت های 3َ پرايمرهای است كه برای عوارض مختلف طراحی شده است. دو واكنش PCR با استفاده از يك DNA الگودر2 تیوب جداگانه انجام می شود، كه يكی از آنها حاوی پرايمرهای جهش يافته و ديگری در برگیرنده پرايمر طبيعي مي باشد. در هرواكنش پرايمر مشترك به همراه يكي از 2 پرايمراختصاصی عوارض و علل مورد استفاده قرارميگيرد. حالت اختصاصی پرايمرها براي هريك ازاهداف ناشی از نوكلئوتايد انتهای 3َ آنهاست كه با هم متفاوت بوده. چنانچه واکنش درتیوب حاوی پرايمر طبيعی انجام شود نشان دهنده نبود جهش نقطه یی در نمونه مورد نظراست واگر واکنش در تیوب حاوی پرايمرجهش يافته انجام شود نشان دهنده حضور جهش نقطه یی در نمونه مورد نظر است. نكته مهم اين است كه از DNAپوليمیرازی كه فاقد خاصيت تصحيح كنندگی انزایم Exonuclease َ5 و َ à 3َ است، استفاده شود. زيرا استفاده از يك انزايم اصلاح گر باعث برداشتن نمونه جفت نشده انتهای 3َ ميگردد و در واقع توانايي متمايز كردن دو عارضه از بين ميرود. از اين روش در تشخيص نوسانهای مولد مقاومت دارويي در باكتري ها استفاده مي شود.

... ادامه دارد